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解釋頁 08 · 第一性原理邏輯鏈 · 給教授的「為什麼可行」走查

點突變 + 甲基能支持什麼？
局部分子狀態候選，不是 clone 真值

以 HCC1395 在 chr2:18,066,481–18,110,828（6 個 sSNV 跨 18,068,480–18,108,828）的一段 SEQC2 LOH annotation-compatible context 為例，逐步拆開這條推理鏈：LOH annotation + HP imbalance 降低兩親本 haplotype 的簡單替代解釋 → 點突變共現/互斥建立局部 mutation-state candidates → 甲基在遺傳分組後呈現有界的一致關聯 → normal ASM screen 標記部分 confound → 只能給 read 帶不確定性的 candidate molecular-state label。未整合 allele-specific CN，不能判定 CN-loss、cnLOH、事件機制或 retained parental copy；甲基不建立、合併或定向 topology edge。

L0 一條邏輯鏈看懂

LOH annotation + HP imbalance→ candidate sSNV＝分子狀態標籤→ 甲基＝分組後有界關聯→ 扣 normal 濾假→ candidate read label + 不確定性

關鍵前提是 LOH annotation-compatible context：SEQC2 註記與 HP2-dominant imbalance 讓「兩條親本 haplotype 本來不同」不再是首要解釋，但allele-specific CN、LOH 機制、定序錯誤、純度、隨機甲基變動與其他 confound 仍未解。通過品質與 linkage 守門後，點突變模式支持局部 mutation-state candidates；甲基模式只是在這個遺傳分組之後觀察到的 association，不是獨立的 cellular-subclone 確認，也不能補 genetic link。

▸ 給教授一句話：資料支持「LOH annotation-compatible context → candidate-variant-conditioned 局部分子狀態 → 分組後甲基差異」這條有界關聯，且部分甲基方向跨 basecaller 重現（basecaller = 把測序電訊號翻成 ATCG 的軟體；HKU 與 DORADO 是同一 biological sample 的兩個 technical datasets／basecalling pipelines，未證明 read-ID 集合完全相同 → 屬技術重現、非獨立病人）。但這是一個有界的結論（tier L2，單一區域案例 × 單一 biological sample × 兩個 technical pipelines）：不是已確認的 cellular clone 數目或 lineage tree，LOH/CN 機制與突變先後都未確認，normal-ASM-screen-negative 也不等於 acquired。

0
pos3=A 與 strict operational (1/2/6) marker union 的 observed co-alt read
4 / 236
HP1-low imbalance（≈1.7%；與 LOH context 相容，非 CN 機制定案）
3.1 / 3.2
normal-ASM-screen-negative 且跨 basecaller 技術重現最強的 CpG；未證明 acquired
unresolved
historical merge-rule 「約 3」只屬 operational labels；非完整 candidate / lineage 數

⓪ 先回答最關鍵的問題：為什麼非得「偵測甲基」不可？

如果只看 candidate variant pattern 就能充分刻畫 local molecular states，何必費力去讀甲基？因為這條軸太稀疏、太脆弱，單靠它常常標不準。甲基提供了三件點突變做不到的事 —— 但也有一條必須誠實守住的邊界。

甲基的三個不可替代價值
  1. 有界一致關聯：點突變在這 40 kb 只有 6 個；在用這些突變分組後，10 個 CpG 提供更密的局部甲基描述。這是同一 biological sample 內、各 technical dataset 的 bounded concordance，不是獨立 cellular-clone 驗證，也不宣稱兩資料集有完全相同的 read-ID 集合。
  2. 救援標記（未驗證未來假說）：目前沒有 per-read truth、預先固定的 classifier、誤差率或救回率。因此甲基是否能補回無遺傳 marker 的 read，必須在獨立 truth 上驗證後才能宣稱，本頁不把它當已觀測產出。
  3. 刻畫局部甲基狀態：現有資料可描述 CpG 甲基狀態與突變分組的關聯。沒有基因表現、染色質可及性或功能擾動資料，所以不能說某群「關掉了哪些基因」。
● 但守住這條邊界（本頁全程不越線）
  1. 這裡甲基是關聯刻畫（association characterization）軸，不是驅動者、更不是變異 filter。本專案已測的 methylation→TP/FP filter formulation 結果為 NEGATIVE；這不等於所有甲基 filter 假說皆不可行，新 formulation 仍須另做 pre-decision audit。
  2. 本案例的有界判讀依賴三個條件：① LOH annotation + HP imbalance 降低雙親本解釋，② mutation markers 定義分子分組，③ matched-normal screen 標記已偵測的等位甲基 confound。即使三者齊備也不能確認 LOH/CN 機制、cellular lineage 或 acquisition，更不能外推到一般非-LOH 位點。

① 為什麼「長 read」是關鍵：同一條分子上同時讀到兩種記號

物理基礎是：一條 ONT long read 取樣一個 DNA 分子，該分子來自某個細胞的某一染色體 copy。但 bulk 資料沒有細胞 barcode，原始細胞身分不可知，也不能自動把不同 reads 配對到同一細胞。可直接觀測的是同一分子上的點突變與甲基化；cellular co-membership/lineage 仍是推論。

圖 1 · 一條 long read 上的兩層記號（基因條碼 + 甲基指紋）
同一條物理 read 上的 mutation 與甲基記號 長讀可在同一條實驗取樣到的物理分子上直接觀察多個 mutation markers 與 CpG methylation；不自動證明來自同一細胞 clone。 一條 ONT long read（約 17 kb 中位長度）跨過整個 chr2:18.07–18.11M 區 = 一個來自某染色體 copy 的分子；原始細胞無 barcode、身分未知 基因條碼 (6 sSNV) 1 2 3 4 5 6 甲基指紋 (10 CpG) ● 甲基化  ○ 未甲基化（此圖為示意位置，非單一 read 真值） 短 read 只能覆蓋這麼一小段 → 跨不過多個記號 → 無法把它們綁在同一條分子上
怎麼讀：上排藍/紅/橘 = 6 個點突變的位置（基因條碼）；下排棒棒糖 = 10 個 CpG 的甲基狀態（表觀指紋）。核心：只有 long read 能在同一條分子上同時讀到上下兩排，因此能把「這條 read 帶哪些突變」與「它的甲基長相」綁在一起。本圖甲基填色為示意位置（真值熱圖見圖 4）；位置座標 = independent_audit.json: snvs / cpg_c_positions 線性映射。
點突變 vs 甲基化一個是序列狀態，一個是可塑的化學修飾
差異：sSNV 改變 DNA 字母，通過品質與 somatic 守門後可作較穩定的分子 marker；5mC 不改字母，受細胞型態、環境、等位背景與技術因素影響。本案例只觀察到甲基與 mutation-defined groups 的局部關聯；沒有細胞 barcode、表現量或功能擾動資料，不能直接把 5mC 稱為 lineage truth 或基因開關的功能證據。

② LOH annotation + HP imbalance 是有界 context，不是機制定案

一般位點有兩條親本 haplotypes（HP1 + HP2），兩條 read 不同可能只是 germline haplotype 差異。此區的 SEQC2 LOH annotation 與 HP2-dominant imbalance 讓這個簡單解釋在 HP2-scoped reads 中大幅降低、但未形式排除；未整合 allele-specific CN，因此不能判 CN-loss、cnLOH、事件機制或 retained parental copy。residual HP1、tagging error、定序錯誤、純度與其他替代解釋仍需獨立守門。

圖 2 · LOH annotation-compatible context：降低雙親本 confound，不判定 CN/LOH 機制
正常細胞 兩條親本染色體都在 HP1 HP2 read 不同 → 可能只是「兩親本本來不同」 ⚠ germline 差異 = confound ⟶ SEQC2 LOH annotation + HP imbalance；機制 unresolved 腫瘤（此 annotation-compatible context） HP1-low / HP2-dominant；非 deletion 證明 HP1 僅 4 條殘餘 (1.7%) HP2 HP2-1 同一 PS=16735547（phase block） 這個 context 能支持什麼： HP2-scoped reads 為主 → 「兩條親本本來不同」這個簡單解釋大幅降低，不是形式排除 → CN-loss vs cnLOH、retained parent、residual HP1、tagging error、序列誤差與純度仍未解。HP2-1 只是 candidate read-group label。
名詞：HP1 / HP2 = 一對親本 haplotype labels；HP2-1 = 同一 PS=16735547 block 內的 somatic-aware candidate read-group label，不是已確認子家族。怎麼讀：右側仍有 HP1 residual：HKU 4 / 236 tagged ≈ 1.7%、DORADO 1 / 280 ≈ 0.4%；因此雙親本解釋只是降低，並須保留 tagging error 與其他替代解釋。來源：independent_audit.json: samples.HKU_T.hp_parent_counts {2:232, 1:4, None:44}、benchmark_context.overlapping_loh_intervals: chr2:16,146,119-22,100,000=loh（SEQC2 CNV/LOH BED）。
這一步成立 · L2SEQC2 LOH annotation、HP1-low imbalance（1.7%）與單一 PS 方向相容，降低「兩親本 haplotype」這個替代解釋；但沒有 allele-specific CN，不能判定 CN-loss vs cnLOH、機制或 retained parent。定序、純度與其他 confound 仍須另行守門。

③ 點突變實際切出什麼：互斥的局部分子狀態候選

承 §②：LOH annotation + HP imbalance 降低雙親本 haplotype confound；再經品質守門後，每條 read 的點突變模式可作分子狀態標籤，但不等於細胞譜系標籤。在現有 coverage 與 strict operational union 下，pos3=A 與 pos1/2/6 markers 沒有觀察到共同 alt。這只約束非時間、非唯一的 compatibility models。(1)(2) block L 與 (4)(6) block R 之間無跨距 read，關係必須保持 unresolved；甲基 association 不能把它們合併成同一 β common node。

圖 3 · read 條碼 pattern → 非時間、非唯一的 compatibility graph
代表 read（· = 未覆蓋此點） (1)(2)(3)(4)(5)(6) candidate state label α 代表 C G A C G C α α-1 代表 C G A C C C α-1 block L 代表 G C G · · · block L block R 代表 · · G alt* G G block R pos3：α=A、β=G(ref) → 0 read 同時帶 α 與 β 突變（互斥） anchor 計數：α(pos3=A)=30 · β-strict(1∨2∨6)=49 · α∧β 違反=0（HKU；DORADO 28 / 44 / 0） ↓ observed pattern 的非時間 compatibility summary；不是 tree ↓ all-REF local reference（非 root / ancestor） α：pos3 G>A α-1 label：+pos5 G>C（conditional pattern；HKU 4/DOR 2） block L：(1)(2) block R：(4)(6) relation unresolved · methylation association adds no edge
怎麼讀：紅 = α 定義突變 (pos3=A)；橘 = unresolved block L / block R markers；紫 = provisional α-1 狀態 (pos5)；· = 該 read 未覆蓋此點。直接觀測：在目前 strict operational union 與有覆蓋 reads 中，pos3=A 與 pos1/2/6 markers 沒有觀察到共同 alt（0 observed）；pos5=C 只見於 pos3=A reads（HKU 4 / DORADO 2 條）。這些 pattern 只約束非時間、非唯一的 compatibility models。block L (1)(2) 與 block R (4)(6) 相距 ~36–40 kb、沒有跨距 read，故關係保持 unresolved；分組後甲基 association 不能橋接、合併或定向兩者。(4)alt* = C>G 為 truth-evaluable TP，但鄰接 20bp 同聚物的 G/T/DEL 三態 homopolymer-uncertain，不作 clone 拆分。來源：independent_audit.json: lineage_anchor_counts、linkage_bq10。

read-level linkage（兩事件是否落在同一條 read 上）

事件組合HKU 共現 (11=兩者皆突變)判讀
(1)G vs (2)Cn=31，11=13same-read 共現 → 同 local-state block candidate
(1)G vs (3)An=13，11=0互斥 → pos3=A group / block L local patterns
(2)C vs (3)An=17，11=0互斥
(3)A vs (5)Cn=13，11=4（且 01=0）目前 covered reads 中 pos5 只見於 pos3=A；α-1 是 provisional candidate label
(4)alt vs (6)Gn=19，11=10同 local-state block candidate → block R 內 (4)(6) 共現
(1)/(2) vs (6)　跨塊n=1–2，11=0（DORADO n=0）無跨距 read → block L (1)(2) 與 block R (4)(6) 的關係 UNRESOLVED；甲基 association 不補 genetic link
這一步成立（分清觀測 vs 推論）· L2觀測：目前有覆蓋 reads 中，pos3=A 與 strict operational pos1/2/6 union 為 0 observed co-alt；pos5 只見於 pos3=A reads（HKU 4 / DORADO 2 條）。模型：conditional pattern 與互斥只約束非時間、非唯一的 compatibility graph；block L / block R 沒有跨距 read，必須保持 unresolved，不能由甲基 association 合併。它不能單獨確定 originating cell、細胞 clone 數目、lineage tree 或功能。

④ 甲基能補充什麼：遺傳分組後的有界一致關聯

先用點突變把 reads 分成 α / β-like，再比較每個 CpG 的平均甲基率；多個 CpG 在兩組之間方向一致地分開，最強的 3.1 / 3.2 換用 DORADO technical dataset 仍重現。這支持同一 biological sample 內的mutation-state-conditioned methylation coherence。但分組與甲基不是獨立量測、HKU/DORADO 也不是 biological replicates，且標籤先由點突變建立，因此不是獨立或正交的 clone 驗證；normal ASM screen 只能標記已偵測到的部分 confound。

圖 4 · 甲基率在 mutation-defined α / β-like groups 間分開（tumor，跨 basecaller）
CpG HKU DORADO α β α β 複製? 2.1 0.75 0.48 n=1 n=1 — 2.2 0.90 0.22 0.80 0.01 — 3.1 ★ 0.22 0.92 0.07 1.00 ✓ 3.2 ★ 0.97 0.14 1.00 0.01 ✓ 3.3 0.42 0.84 0.26 0.99 ✓ 3.4 0.04 0.87 0.26 0.86 — 3.5 0.01 0.87 0.38 0.84 — 4.1 0.98 0.14 0.97 0.40 — 5.1 0.03 0.95 0.50 n2 1.00 n1 — 5.2 0.03 0.99 0.01 n2 1.00 n1 — 甲基率分桶： 0 0.5 1（高甲基） ★ = normal-ASM-screen-negative 且 DORADO 重現（未證明 acquired）
怎麼讀：每列一個 CpG，左半 HKU、右半 DORADO，各分 α / β-like 兩欄；藍=低甲基、紅=高甲基，格內數字為精確 meanM（色為視覺分桶）。核心：多個 CpG 在遺傳分組後方向一致地分開（如 3.1 α低β高、3.2 α高β低），且 3.1 / 3.2 換 basecaller 仍重現（FDR：HKU 3.3e-04 / 4.1e-05；DORADO 皆 2.4e-05）。這是組間甲基關聯與技術重現，不足以證明 cellular lineage 或獨立 clone。DORADO α/β 在 5.1/5.2 僅 n=1–2，不足採信。來源：independent_audit.json: methyl_alpha_vs_pos3_ref（HKU）+ DORADO 對應欄；07 工作站同源注入。
這一步成立但有界 · L2甲基在 α / β-like 遺傳分組後呈方向一致差異 = bounded methylation coherence；它不獨立定義或確認 clone。部分差異在正常組織已有等位效應，須用 matched-normal screen 標成 confounded；screen-negative 子集仍只代表未偵測到該項 confound。

⑤ 為什麼要再用正常組織對照：濾掉「假的」甲基訊號

這一步是誠實的關鍵：α / β-like 甲基差異不等於後天 acquired。正常組織本來就可能有等位特異甲基（germline ASM），會造成與腫瘤分組相似的差異。matched-normal HP1 vs HP2 screen 能把已觀察到正常等位差異的 CpG 標為 confounded；normal 未達顯著者只能稱 normal-ASM-screen-negative，不能據此證明該差異在腫瘤中新生。

圖 5 · 正常組織對照：哪些 CpG 通過 normal-ASM screen？
CpG 腫瘤 α / β (是否分開) 正常組織 HP1 / HP2 (對照：本來就有差異?) 判定 2.1 0.75 0.48 0.03 0.04 SCREEN-NEGATIVE 2.2 0.90 0.22 0.04 0.01 SCREEN-NEGATIVE 3.1 ★ 0.22 0.92 0.05 0.04 SCREEN-NEGATIVE ★ 3.2 ★ 0.97 0.14 0.05 0.12 SCREEN-NEGATIVE ★ 3.3 0.42 0.84 0.81 0.05 CONFOUNDED 3.4 0.04 0.87 0.03 0.85 CONFOUNDED 3.5 0.01 0.87 0.58 0.01 CONFOUNDED 4.1 0.98 0.14 0.89 0.08 CONFOUNDED 5.1 0.03 0.95 0.04 0.03 SCREEN-NEGATIVE 5.2 0.03 0.99 0.03 0.03 SCREEN-NEGATIVE screen：normal HP1-vs-HP2 FDR < 0.05 ⇒ CONFOUNDED；否則 SCREEN-NEGATIVE（非 acquired 證明）。★ = DORADO 重現。
怎麼讀：左 = 腫瘤 α/β-like（同圖 4），右 = 配對正常組織的 HP1/HP2。3.3/3.4/3.5/4.1 在正常組織已有明顯等位差異（如 3.4 normal 0.03 vs 0.85）→ CONFOUNDED；2.1/2.2/3.1/3.2/5.1/5.2 在此 screen 未見顯著 normal HP 差異 → SCREEN-NEGATIVE。後者較適合作為腫瘤相關候選，但 screen-negative 不是 acquired 的正面證據。最強技術重現 = {3.1, 3.2}（screen-negative ∩ 跨 basecaller 重現）。來源：independent_audit.json: methyl_normal_hp1_vs_hp2 的 norm_fdr 欄。
誠實校正 · L2資料支持 tumor-associated、normal-ASM-screen-negative 的分組後甲基差異（3.1/3.2 技術重現最強），不支持「已證明後天 subclone methylation」。正常對照可抓出 4 個明顯 germline-ASM confound，但不能把未抓到 confound 等同不存在 confound。

⑥ 怎麼給 read 一個可稽核的 candidate molecular-state label？

現有資料可依三層直接觀測標記 reads：① haplotag HP；② 覆蓋且通過品質門檻的 pos3=A、block L 或 block R 點突變狀態；③ pos5 支持的 provisional α-1 狀態。block L / block R 關係 unresolved；未覆蓋 marker 的 read 應保留 unassigned/uncertain，不能由本案例的甲基關聯自動補成「正確 clone tag」。甲基救援需要獨立 per-read truth、預先固定 classifier 與錯誤率驗證，目前尚未完成。

圖 6 · 一條 read 如何得到帶不確定性的觀測標籤
一條 read(一個分子) → ① 染色體層 haplotag HP HP2 (LOH annotation + HP imbalance；HP2-scoped，CN 機制未解) → ② mutation-state 層 點突變條碼 α 或 β (pos3=A? vs 1/2/6 突變?) → ③ provisional conditional state pos5 突變? α → α-1 (pos5=C only observed in α-labeled reads) → candidate label α / α-1 / block L / block R / uncertain 甲基關聯（圖 4/5；本案例僅作群組後描述） 不自動補標 read；救援須另建 classifier + 獨立 per-read truth 驗證 觀測標籤 = HP × 覆蓋到的 mutation state；無 marker 就保留 uncertain 甲基可描述群組後關聯；尚未驗證能確認 clone 或救援未定相 reads
怎麼讀：由左到右只使用直接覆蓋到的 HP 與高品質 mutation markers，得到 candidate molecular-state label；marker 未覆蓋或相衝突時保留 uncertain。下方甲基只表示已觀察到的群組後關聯，不是本案例已驗證的逐-read 補標機制。「甲基救援」仍是待測假說，需獨立 truth 與 error-rate benchmark。來源：HP samples.HKU_T.hp_counts、α/β lineage_anchor_counts、α-1 linkage_bq10.E3_vs_E5。
● 標 tag 時必守的三條誠實底線（對抗式複核抓出的過度宣稱已撤回）
  1. 是局部 mutation-state candidates，不是已確認的 cellular lineages，更不是「5 群」。pos4(chr2:18,096,269) 的 C>G 是 truth-evaluable TP，但後面緊接 20bp poly-T；觀測到的 G/T/DEL 三態屬 homopolymer-uncertain（HKU bq20 計數 C:21 / T:13 / DEL:10 / G:4，且 4 條 G 全是 reverse strand），不可拆成三個真 subclone，只能作 block R 內的 operational pos4-altered state。
  2. 突變的先後與分支關係是 parsimony 候選，不是觀測。0 observed co-alt 與巢狀模式不會讓局部樹唯一可識別；不能用局部 VAF 排先後（LOH、copy number、純度都會扭曲），(4)(6) 共現也無法排序。
  3. pos3 是「真值空隙」不是 FP。pos3(chr2:18,086,020) 落在 SEQC2 高信賴區間的空隙裡 → 外部真值無法評估（不是被判為假陽性）；它當 α 的 pivot 只有內部 read linkage 支持，外部無真值可確認。
  4. block L (1)(2) 與 block R (4)(6) 的關係 unresolved。兩塊相距 ~36–40 kb、沒有跨距 read 把它們連在同一條分子上（HKU 跨塊 n=1–2、11=0；DORADO n=0）。分組後甲基一致性是 association-only，不能橋接、合併、定向 topology edge，或建立共同 β node。勿寫成「兩 block 已屬單一分支」。

⑦ 收尾對照：只有點突變 vs 加上甲基

把「為什麼要偵測甲基」用一張對照圖收尾。左邊是只靠點突變能做到的（稀疏、有 read 標不到、低訊號變異難確認）；右邊是加上甲基後多出來的能力。

圖 7 · 沒有甲基 vs 有甲基
有無甲基資訊的分工對照 遺傳 mutation linkage 定義局部、模型條件下的候選結構；甲基資訊只做分組後關聯描述，不改變候選邊或確認 lineage。 只有點突變(sSNV) 40 kb 只有 6 個資訊位點 · 覆蓋低 部分 read 跨不到任何位點 → ? ✗ 很多 read 無法定相 → 標不到 tag ✗ 低-VAF 變異（如 pos5 僅少數 read）難確認 ✗ 只知道「身分不同」，不知功能 ✗ 單一證據軸 → 容易把噪音當訊號 ＋ 偵測甲基 同 40 kb 多了 10 個 CpG · 密集第二軸 ✓ 有界一致關聯：遺傳分組後甲基方向相容 ◷ 救援標記是假說：尚無 per-read truth / 誤差率 ✓ 刻畫局部甲基狀態：不能直接推論基因功能 ✓ 3.1/3.2 跨 basecaller 技術重現（同一樣本）
怎麼讀：左 = 點突變 markers 稀疏；右 = 甲基可提供較密的局部狀態描述。本案例實證的是「遺傳分組後的甲基關聯」與部分 CpG 的跨 basecaller 技術重現；沒有實證甲基能獨立確認 clone、救援未標 reads 或解釋基因功能。● = 甲基化、○ = 未甲基化（示意）。
本頁總結在此單一 LOH annotation-compatible context 與單一樣本中，read-level 點突變支持局部 mutation-state candidates；block L / block R 關係 unresolved。甲基在遺傳分組後呈有界關聯，3.1/3.2 有跨 basecaller 技術重現，但不提供 topology edge。可交付的是帶不確定性的 candidate molecular-state label 與局部甲基描述；confirmed cellular lineage = 0。不可交付的是已確認 cellular clone、唯一 lineage tree、corrected CCF、LOH/CN 機制、甲基救援真值或功能結論。

⑧ 限制與證據邊界（教學頁不藏 caveat）

這些是把本頁結論寫進論文/報告時必須一起帶上的邊界。完整權威裁決見 頁 05 與 verdict_02。

整體 tier = L2：單一區域案例 × 單一 biological sample × 兩 technical datasets
cross-basecaller（HKU vs DORADO）是同一細胞株的技術/資料重現，不是獨立的生物學重複。要升 ★4 需要第二個樣本（如 COLO829）或第二個 LOH 位點。
pos3 落 SEQC2 高信賴區間「空隙」→ 外部真值不可評估（非 FP）
α-like 候選狀態的 pivot 突變只有內部 read linkage 支持，外部真值集無法確認此點。
LOH/CN 與甲基 confound 未完全形式排除
3.3/3.4/3.5/4.1 在配對正常組織已有顯著 germline ASM；其餘只能稱 normal-ASM-screen-negative。未整合 allele-specific CN，不能判定 CN-loss vs cnLOH、事件機制、retained parent 或等位甲基差異如何延續；因此 screen-negative 不是 acquired 的正面證據，甲基也不能補 topology edge。
「0 違反」僅限 strict 定義；DORADO normal 未 tag
放寬的 pos4-β 定義在 DORADO 有 1 條 discordant read；多組遠距 pair 無跨距 read，故「0 observed」非強跨資料複製。germline-ASM confound 檢定僅靠 HKU normal，confound 側未跨 basecaller 複製。
外部驗證三層裁決（防 over-claim）
① 區域有 somatic 事件 = YES；② 被外部 characterize 為 subclone = PARTIAL（sample-level YES〔Fang 2021〕、locus-level NO）；③ 我方假想樹被外部逐節點 reproduce = NO。禁寫「確認 5 subclone / 完整演化樹」「SEQC2 驗證此區是一個 subclone」「甲基 driver / 獨立重建」「DORADO 是獨立病人」。
可防守的一句話（投稿口徑）Local, LOH-annotation-compatible mutation-state candidates with bounded, mutation-conditioned methylation association and cross-basecaller technical reproducibility. —— 不是 "Confirmed five-subclone evolutionary reconstruction."
案例校正走查 04 權威 audit 05 ISM subclone pipeline 構想 06 互動判讀工作站 07