🔬 chr2:18M 分子狀態候選 — 判讀工作站 tier L2 PARTIAL

HCC1395 · chr2:18066481-18110828 · 6 sSNV × 10 CpG · HKU(5mCG_5hmCG haplotag) + DORADO cross-basecaller · 權威 SoT = independent_audit.json + verdict_02 · revision UNCOMMITTED_CANDIDATE atop 419d6ca08f32
規格所列 metric 由 generator 從來源檔注入，缺必填值即 refuse； hover ⌖ 來源 看出處。下方 sSNV 卡可記你的判讀，右上匯出 JSON/CSV。

最終可防守結論（verdict_02 §最終裁決）

在 SEQC2 LOH-annotated 區域中，read-level allele linkage 支持局部 molecular-state candidates；在 shared-coverage reads 內，(5)C 只於 (3)A-bearing reads 觀測到，屬 provisional nesting pattern，不代表 parent/child 或發生次序。甲基只支持 mutation-defined 分組後的有界關聯與跨 basecaller 技術重現，不確認 cellular subclone、linear ancestry、完整演化順序或因果。
Claim ceiling：confirmed cellular subclone = 0；confirmed linear ancestry = 0。alpha / beta 等皆為本區域的操作性 read-state labels。
適合論文用語Local read-level molecular-state candidates in a SEQC2 LOH-annotated interval with bounded, mutation-conditioned methylation association.
✗ 不適合：Confirmed five-subclone evolutionary reconstruction.

① 6 個 sSNV 證據卡

tumor/normal allele 為 unique primary reads BQ20 count。pos3 落 HC 空隙＝truth 無法評估（非 FP）。 來源 ⌖ independent_audit.json: snvs/benchmark_context/allele_counts_bq20 + ⌖ concordance.tsv。

(1) chr2:18,068,480 C>G

truth_confirmed
歷史操作性標籤（非譜系）beta-like local marker set A
SEQC2 TVAF / 歷史近似轉換0.403 / 0.814 非 canonical CCF；不作 clone 判定
HKU tumor BQ20C:22, G:16
DORADO tumor BQ20C:22, G:18
HKU normal BQ20C:18, DEL:1
我的判讀:

(2) chr2:18,072,546 G>C

truth_confirmed
歷史操作性標籤（非譜系）beta-like local marker set A
SEQC2 TVAF / 歷史近似轉換0.389 / 0.786 非 canonical CCF；不作 clone 判定
HKU tumor BQ20G:25, C:21
DORADO tumor BQ20G:27, C:18, DEL:1
HKU normal BQ20G:21
我的判讀:

(3) chr2:18,086,020 G>A

out-of-HC・truth-unevaluable（非 FP）
歷史操作性標籤（非譜系）alpha local read-state label（HC gap）
SEQC2 TVAF / 歷史近似轉換. / . n/a
HKU tumor BQ20G:30, A:29
DORADO tumor BQ20G:27, A:21
HKU normal BQ20G:18
我的判讀:

(4) chr2:18,096,269 C>G/T/DEL

truth_confirmed
歷史操作性標籤（非譜系）beta-like local marker set B（homopolymer-uncertain）
SEQC2 TVAF / 歷史近似轉換0.242 / 0.489 非 canonical CCF；不作 clone 判定
HKU tumor BQ20C:21, T:13, DEL:10, G:4
DORADO tumor BQ20C:29, T:15, DEL:7, G:6
HKU normal BQ20C:21, T:1
我的判讀:

(5) chr2:18,099,697 G>C

truth_confirmed
歷史操作性標籤（非譜系）alpha+(5) nested-read pattern（low VAF；非方向）
SEQC2 TVAF / 歷史近似轉換0.048 / 0.097 非 canonical CCF；不作 clone 判定
HKU tumor BQ20G:23, C:11, DEL:1
DORADO tumor BQ20G:22, C:18, DEL:1
HKU normal BQ20G:17
我的判讀:

(6) chr2:18,108,828 C>G

truth_confirmed
歷史操作性標籤（非譜系）beta-like local marker set B
SEQC2 TVAF / 歷史近似轉換0.382 / 0.772 非 canonical CCF；不作 clone 判定
HKU tumor BQ20C:20, G:9
DORADO tumor BQ20C:43, G:10, DEL:3
HKU normal BQ20C:19
我的判讀:

② α / β-strict 操作性 read-state labels

operational read-state counts

HKU α(pos3=A) / β-strict30 / 49
HKU α∧β 違反 read0
DORADO α / β-strict28 / 44
DORADO α∧β 違反 read0
⌖ independent_audit.json: samples.*.lineage_anchor_counts（source key 為歷史命名；此頁不作 lineage claim）

判讀

α = (3)A；β-strict = (1)G∨(2)C∨(6)G。於已評估 reads、此 strict 定義下，兩 basecaller 均觀測到 0 strict 違反。 ⚠ 這不是 lineage 證明；broadened pos4-β 在 DORADO 有 1 discordant（見限制）。

read-level linkage（00/10/01/11；11=兩事件同 read）

事件組合HKUDORADO判讀
(1)G vs (2)C18/0/0/13 (n=31)11/1/0/6 (n=18)同一 read 共現
(1)G vs (3)A3/3/7/0 (n=13)0/0/0/0 (n=0)本 read 集合未觀測共同 ALT
(2)C vs (3)A3/5/9/0 (n=17)0/1/0/0 (n=1)本 read 集合未觀測共同 ALT
(3)A vs (5)C8/1/0/4 (n=13)1/2/0/2 (n=5)(5)C 僅見於 (3)A-bearing shared-coverage reads（局部 nesting；非次序）
(3)A vs (4)alt0/9/13/0 (n=22)0/7/5/1 (n=13)主要未觀測共同 ALT
(3)A vs (6)G0/3/3/0 (n=6)0/0/0/0 (n=0)本 read 集合未觀測共同 ALT
(4)alt vs (6)G9/0/0/10 (n=19)1/0/0/1 (n=2)同一 read-state 共現
(5)C vs (6)G3/7/11/0 (n=21)1/7/0/0 (n=8)本 read 集合未觀測共同 ALT（非 lineage）

⌖ independent_audit.json: samples.{HKU_T,DORADO_TAGGED_T}.linkage_bq10 · 對照 verdict_02:140-147

③ SEQC2 LOH 區域標註 + tumor HP-tag imbalance

HKU tumor HP

HP2-tag232
HP1-tag4（1.7%）
HP2 佔 tagged98.3%

DORADO tumor HP

HP2-tag279
HP1-tag1
HP2 佔 tagged99.6%

外部 / normal

SEQC2 LOH BEDchr2:16,146,119-22,100,000
normal pos3 (A/G)0 / 18（100% REF）
all-REF 短 linkage read 存在（HKU ≥2pt=17）→「HP2 突變到不見」否定

有界裁決：SEQC2 BED 標記此區為 LOH，且兩個 tumor tagged-read 集合皆呈 HP2 imbalance；本頁未整合 allele-specific CN，也不由此獨立確認 LOH 機制或「單親保留」。

④ 甲基化三組（這是最容易誤讀的地方）

tumor α(pos3=A) vs β(pos3=G) 每 CpG meanM；右側 normal HP1/HP2 = matched-normal germline ASM。 screen 由資料算出：normal MW-FDR<0.05 ⇒ germline-ASM confounded；否則 NORMAL-ASM-SCREEN-NEGATIVE（不證明 acquired）。 DORADO✓ = DORADO tumor α/β FDR<0.05 且同方向。

甲基化三組熱圖逐 CpG 比較 HKU 與 DORADO 的 mutation-conditioned 甲基值及 matched-normal ASM screen；screen-negative 不表示 acquired 或 clone-specific。HKU αHKU βDOR αDOR βN·HP1N·HP2CpGtumor α(=pos3 A) vs β(=pos3 G)normal ASM2.1180739870.75 n90.48 n80.01 n10.02 n10.030.04SCREEN-NEGDORADO 複製 FDR<0.05: FalseDOR—2.2180764080.90 n140.22 n90.80 n50.01 n20.040.01SCREEN-NEGDORADO 複製 FDR<0.05: FalseDOR—3.1180909470.22 n200.92 n190.07 n151.00 n130.050.04SCREEN-NEG★DORADO 複製 FDR<0.05: TrueDOR✓3.2180915830.97 n190.14 n171.00 n150.01 n90.050.12SCREEN-NEG★DORADO 複製 FDR<0.05: TrueDOR✓3.3180934130.42 n140.84 n160.26 n120.99 n90.810.05germline-ASMDORADO 複製 FDR<0.05: TrueDOR✓3.4180941130.04 n140.87 n150.26 n80.86 n70.030.85germline-ASMDORADO 複製 FDR<0.05: FalseDOR—3.5180960320.01 n90.87 n130.38 n80.84 n60.580.01germline-ASMDORADO 複製 FDR<0.05: FalseDOR—4.1180963400.98 n90.14 n120.97 n80.40 n50.890.08germline-ASMDORADO 複製 FDR<0.05: FalseDOR—5.1181005430.03 n50.95 n80.50 n21.00 n10.040.03SCREEN-NEGDORADO 複製 FDR<0.05: FalseDOR—5.2181006820.03 n50.99 n70.01 n21.00 n10.030.03SCREEN-NEGDORADO 複製 FDR<0.05: FalseDOR—
圖4 · 甲基三組熱圖（藍=低甲基→紅=高甲基）。 SCREEN-NEG★ = normal-ASM-screen-negative 且 DORADO 技術重現（3.1, 3.2；不證明 acquired/clone）。資料源 ⌖ independent_audit.json methyl_alpha_vs_pos3_ref + methyl_normal_hp1_vs_hp2。 缺必填值會 refuse 而非顯示「—」（修掉舊 Fig4 的 v1/v2 漂移）。

三組結論

normal-ASM-screen-negative2.1, 2.2, 3.1, 3.2, 5.1, 5.2 （tumor-associated；非 acquired 證明）
CONFOUNDED（germline-ASM）3.3, 3.4, 3.5, 4.1
DORADO 複製3.1, 3.2, 3.3
screen-negative ∩ DORADO 技術重現3.1, 3.2
⚠ 報告A 曾寫 DORADO 複製={2.1,2.2,3.1,3.2,3.3}，已修正（見限制末表）。
CpGHKU α/βHKU FDRDOR α/βDOR FDR normal HP1/HP2normal FDR分類DOR✓
2.10.75/0.480.1760.01/0.02NA0.03/0.040.412SCREEN-NEG—
2.20.90/0.220.0030.80/0.010.1350.04/0.010.055SCREEN-NEG—
3.10.22/0.923.3e-040.07/1.002.4e-050.05/0.040.412SCREEN-NEG★✓
3.20.97/0.144.1e-051.00/0.012.4e-050.05/0.120.496SCREEN-NEG★✓
3.30.42/0.840.0250.26/0.990.0060.81/0.050.007germline-ASM✓
3.40.04/0.874.1e-050.26/0.860.060.03/0.850.007germline-ASM—
3.50.01/0.870.0020.38/0.840.0840.58/0.010.05germline-ASM—
4.10.98/0.140.0030.97/0.400.0840.89/0.080.007germline-ASM—
5.10.03/0.950.0060.50/1.00NA0.04/0.030.299SCREEN-NEG—
5.20.03/0.990.0060.01/1.00NA0.03/0.030.412SCREEN-NEG—

⑤ pos4 G/T/DEL 為何不足以支持三個 cellular subclone

chr2:18,096,269 鄰接約 20 bp poly-T homopolymer；觀測到的 G/T/DEL 混合 calls 與 homopolymer-associated calling uncertainty 相容，不能當作三個 cellular subclone 的證據。

DatasetREF CGTDEL
HKU BQ202141410
DORADO BQ20296167

HKU 的 G 僅 4 條且全 reverse strand → 不可視為乾淨獨立群。⌖ independent_audit.json: pos4_subtype_summary（[推論6] 否定）。

⑥ 歷史、案例特定的 TVAF 近似轉換（非 canonical CCF）

歷史案例特定 TVAF 近似轉換這不是 allele-specific CN、LOH、純度與 multiplicity 校正後的 canonical CCF，不能作 clone 佐證。歷史 0.85 參考線（非現行 gate）0.10chr2:18,099,697VAF 0.0480.49chr2:18,096,269VAF 0.2420.77chr2:18,108,828VAF 0.3820.79chr2:18,072,546VAF 0.3890.81chr2:18,068,480VAF 0.403↑ 近似轉換值
圖 5 · 這些值是早期以 SEQC2 consensus TVAF 套入簡化式的案例特定近似轉換。現行 canonical 分析未整合 allele-specific CN、LOH、purity、multiplicity，因此本圖不是 CN/LOH-corrected CCF，不能作 clone 結構佐證或 clonal/minor 分類。in_truth=5/6（pos3 無外部真值）。⌖ chr2_18M_seqc2_concordance.tsv。

⑦ 有界 local read-state candidate graph + 6 推論裁決

有界的局部 read-state 候選圖 無方向、非時間、非唯一的 read-level 共現圖；不代表已確認的 cellular clone、parent-child 或 lineage tree。 layout 僅整理局部 read 共現／未共現；線段無方向，不編碼先後或 ancestry all-REF local read pattern（非 ancestor） alpha label: (3) G>A alpha+(5) nested-read pattern subset pattern；非 parent/child，非時間箭頭 beta-like operational label (1)C>G + (2)G>C (4) C>G* + (6)C>G 兩 local patterns 缺直接 spanning-read bridge；關係未定 (4) G/T/DEL 合併為 homopolymer-uncertain state confirmed cellular subclone = 0；confirmed linear ancestry = 0
圖6 · 非時間、無方向的 local read-state candidate graph。圖形只整理共現／未共現與資料缺口；不代表 cellular clone、parent-child 或 linear ancestry。
#推論裁決修正版 / 依據
1此區與 SEQC2 LOH 標註相符支持・有界SEQC2 LOH BED 涵蓋此區，且 HKU/DORADO tumor tagged reads 呈 HP2 imbalance；本頁未獨立確認 LOH 機制、allele-specific CN 或單親保留 ⌖ verdict_02:267
2存在局部 read-level 分子狀態候選支持・有界可稱 local molecular-state candidates；非 biological clone truth，亦非 lineage ⌖ verdict_02:268
3HP2 沒抽到／突變到不見否定HP2 是主體；all-REF 短 linkage reads 存在；完整 read 缺失是 coverage ⌖ verdict_02:269
4(1)(2)(3)(6) 先突變不成立・需重寫read-level 共現／未共現不足以建立 trunk、先後或 ancestry；僅支持互斥的 local read-state candidates ⌖ verdict_02:270
5(5) 是否呈現 (3)A-conditioned 局部 pattern支持 (provisional)在有共同覆蓋的 reads 中，(5)C 僅與 (3)A 共現；HKU 4 / DORADO 2。這是局部 nesting pattern，不代表 parent/child 或發生次序 ⌖ verdict_02:271
6(4) 多突變造成三群否定合併為 pos4-altered beta-like state；G/T/DEL 為 homopolymer-uncertain ⌖ verdict_02:272

3 處過度宣稱已撤回

⑧ 限制 + 報告A vs 權威數字校正

整體 tier = L2
單一區域案例 × 單一 biological sample × 兩個 technical datasets；cross-basecaller (HKU vs DORADO) 是同細胞株的技術/資料重現，非獨立 biological replicate（升 ★4 需 COLO829 等第二樣本）。 ⌖ verdict_02:314 / critical_audit_03
pos3 (3) 落 SEQC2 HC 空隙
out-of-HC truth-unevaluable，不能由此頁判為 SEQC2 FP 或 TP；alpha 操作性標籤只靠內部 read linkage，外部無真值可確認。 ⌖ verdict_02:81-91
甲基 confound 未完全形式排除
3.3/3.4/3.5/4.1 在 matched-normal 已有顯著 germline ASM；其餘只能稱 tumor-associated、normal-ASM-screen-negative，不能據此證明 acquired 或 cellular-subclone-specific。 ⌖ verdict_02:205-225
「0 違反」僅 strict 定義
broadened pos4-beta 在 DORADO 有 1 條 discordant read；多組遠距 pair 無跨距 read，故「0 observed」非強 cross-data 複製。 ⌖ critical_audit_03 High-2
DORADO normal 未 tag
germline-ASM confound 檢定僅靠 HKU normal；confound 側未跨 basecaller 複製。 ⌖ independent_audit.md:244-257

報告A（草稿）↔ 權威值 校正表

指標報告A（已過時）權威值來源
all-REF reads (≥2 clean pts)報告A: 22/17權威(audit): 17/15⌖ independent_audit.md:63,152
pos3 tumor 分子數報告A: 30/28 (BQ10)權威 BQ20: HKU 29/30・DORADO 21/27⌖ independent_audit.md:36,125
DORADO 複製的乾淨 CpG報告A: {2.1,2.2,3.1,3.2,3.3}權威: 乾淨∩DORADO複製 = {3.1,3.2}（3.3 屬 confound）⌖ verdict_02:221 / methyl table
「乾淨 somatic 甲基案例」報告A: 乾淨案例權威: 混合 (normal ASM + tumor-associated)；normal-ASM-screen-negative 子集={2.1,2.2,3.1,3.2,5.1,5.2}，未證明 acquired⌖ verdict_02:215-225
TVAF 口徑早期 bwaTVAF: .396/.297/.050/.389權威 consensus: .403/.389/.242/.048/.382⌖ concordance_demo:43