以 HCC1395 在 chr2:18,068,480–18,108,828 的一段 SEQC2 LOH 註記相容區為例：6 個 candidate sSNV + 甲基化訊號，如何從 long-read 分子證據建立局部、允許 recurrence、非時間且非唯一的 mutation-state compatibility graph。本頁並陳兩個階段 — 先看研究者用 IGV 手動推出的歷史直覺，再用實際 BAM 資料一步步驗證、並誠實校正過度宣稱。它不確認細胞 clone、真實演化譜系或 LOH 的 copy-number 機制。
SEQC2 LOH annotation 與 HP2-dominant imbalance 相容於 LOH context，因此「兩條親本 haplotype 本來不同」這個簡單替代解釋在 HP2-scoped reads 中大幅降低；residual HP1、tagging error 與其他 confound 仍未形式排除。此分析未整合 allele-specific CN，不能區分 deletion/CN-loss、copy-neutral LOH（cnLOH）、其他機制或判定保留哪一條親本 copy。觀測到的 candidate-allele 共現/互斥模式支持區域 molecular-state candidates；甲基化只是在遺傳分組後觀察到的有界關聯，不能建立、合併或定向 topology edge。這不等於細胞譜系或 clone 已獲證。
▸ 給教授一句話：本案支持局部、允許 recurrence 的突變狀態候選，並觀察到跨 basecaller 的甲基關聯；但「5 群」、唯一順序、細胞 subclone 身分與甲基化取得時點都沒有被確認。證據天花板：分子層候選（單一區域案例含 6 sSNV × 單一 biological sample；HKU/DORADO 為技術重現）。
20bp poly-T homopolymer（ONT 最易出錯的情境），G/T/DEL 三態不可當三個真 subclone。歷史 merge rule 所稱「約 3」只是一組 operational labels；block L / block R 關係仍 unresolved，不能把它當 biological lower bound 或完整 candidate count。本頁是教學敘述（手動直覺→校正）。之後一個更嚴謹的第二輪獨立 audit（含 matched-normal ASM 控制 + 跨 basecaller FDR）做出權威裁決，並修正本頁兩處仍偏寬的判定 — 解釋頁 05 · 權威矯正 audit。兩處更新： ① 推論 4 由「順序 L3」改判為「否定／需重寫」（pos3 與 pos1/2/6 互斥，不能同 trunk）； ② 甲基子集改為 normal-ASM-screen-negative {2.1,2.2,3.1,3.2,5.1,5.2}（3.1/3.2 技術重現最強；{3.3,3.4,3.5,4.1} 被既存 ASM confound；screen-negative 不證明 acquired）。本頁 §④/§⑤/§⑦ 已標註，細節以頁 05 為準。
先看地圖。橫軸是 chr2 約 40 kb 的範圍，上面有 6 個 candidate sSNV。其中 5 個有 SEQC2 真值集驗證為 TP，另 1 個落在 truth-set HC 空隙、屬 truth-unevaluable；tumor/normal 觀測只支持 tumor-associated candidate，不證明 acquired/somatic causation。下面逐一驗。
C>G 是 truth-evaluable TP，但鄰接 20bp 同聚物，觀測到的 G/T/DEL 三態屬 homopolymer-uncertain，不能拆成三個狀態。來源：hku_mod_analysis.txt S1（每點 ref/alt + normal=REF）、SEQC2 truth VCF/BED、GRCh38 序列。PS=16735547。這是同一 phase-block 內的haplotag read families，不是第二條親本，也不識別單一實體染色體 copy 或 originating cell；它只能作局部分子狀態候選的技術容器。這一節忠實重現研究者用 IGV 肉眼觀察推出的重建 — 包含後來被校正的「5 群」與順序分類。先看直覺全貌，下一節再逐步用資料檢驗。（藍紫底 = 直覺階段，尚未經資料驗證。）
| 研究者推論 | 內容（直覺階段，原話） |
|---|---|
| 推論 1 | 這段是 LOH，被分到 HP2 與 HP2-1。 |
| 推論 2 | Normal sampled reads 在候選位點沒有 ALT 支持 → 與 tumor-associated mutation-state candidate 相容；不單獨證明 acquisition 或 cellular subclone。 |
| 推論 3 | HP2 可能因競爭或全部突變，最後沒抽到 read 資訊。 |
| 推論 4 | 多個甲基位點把兩群分很開 → sSNV (1)(2)(3)(6) 較早突變。 |
| 推論 5 | sSNV (5) 突變把 群一、群二 分開。 |
| 推論 6 | sSNV (4) 發生多突變 → 造成 群三、群四、群五。 |
| 分類 | 比對 REF 算突變次數 → α：2-1 / 2-1-1；β：2-2-1 / 2-2-2 / 2-2-3。 |
現在把每個推論拉到實際 BAM 資料前面檢驗。每張卡 = 研究者宣稱 → 實測證據 → 判定（含 tier）；caveat 收進可展開區。綠＝獲證、橘＝部分成立需限定、紅＝需校正。
在目前 strict operational union 與有覆蓋 reads 中，pos3=A 對 pos1/2/6 marker union 為 0 observed co-alt。HKU 有直接 pair evidence；DORADO 的 strict aggregate 也為 0 observed，但多個遠距 pair 的 shared coverage 只有 n=0/1，因此不能稱為獨立複製，也不能由 absence 建立 ancestry。
HKU tagged-read HP 標籤分佈為 HP1=4、HP2=232，即 4 / 236 tagged = 1.7%，與 SEQC2 LOH annotation 方向相容；HP2 與 HP2-1 共用同一個 phase block（PS=16735547），是同一 phase-block 內的 read-family labels，不是第二條親本的直接證據。沒有 allele-specific CN，不能從此判定 CN-loss、cnLOH、事件機制或單親保留。
Normal 在候選 somatic 位點 pos2 / pos3 的非 REF 支持為 0/48、0/36（兩 basecaller 合計），與 tumor-associated variant 相容；但 absence in sampled normal reads 不單獨證明 acquisition。LOH annotation-compatible context + mutation patterns 支持 HP2-scoped reads 內的局部分子狀態候選，不確認保留的親本 copy、cellular subclone 或機制。
● 這是覆蓋假象，不是生物事實。能同時覆蓋 ≥4 個 sSNV 的 read 只有 14 條（跨度太大、long read 也難全覆蓋）；按 independent audit 的 BQ20／≥2 已覆蓋 clean-point 口徑，則有 17 條(HKU) / 15 條(DORADO) all-REF local read patterns。這些只是在其實際覆蓋位點為 REF，不代表已觀測到 ancestor。
● 承重校正：第 4 個位點 chr2:18,096,269（ref=C）緊接 20 個 T 的同聚物。C>G 是 truth-evaluable TP；但原群三/四/五只差 pos4 的 G/T/DEL，因此這三態不可拆成三個真 subclone，只能標為block R 內 homopolymer-uncertain 的 operational pos4-altered state。
samtools faidx GRCh38 chr2:18096244-18096294 本 session 重驗（CATTTCCAGAGCTCTGTACTCTAGTC + 20×T + GAGAC）；pos4 allele = hku_mod_analysis.txt（tumor C:28/T:18/DEL:12/G:6；normal C:44/96%）。ONT-homopolymer-uncertain。● 否定：把 (1)(2)(3)(6) 當「同一組早突變」是錯的。pos3=A 與 pos1/2/6 markers 在目前有覆蓋 reads 中互斥（連鎖表 (2)C×(3)A = 3/5/9/0、(3)A×(6)G = 0/3/3/0，共現 11 欄皆 0）；直接資料只支持互斥的 local molecular-state candidate labels，不確認 trunk、early branch、細胞分支或先後。confirmed cellular lineage = 0。
pos5=C 只觀察在帶 pos3=A 的 shared-coverage reads 上（如 12582ff3 = C·G·A·C·C）；double-ALT 為 HKU=4／DORADO=2。這是 provisional conditional pattern，不確認 parent/child、取得順序、cellular identity 或 lineage。
● VAF 排序撤回：在 LOH annotation-compatible context，局部 VAF 受 unresolved copy number、純度與抽樣影響（pos5 局部 VAF=0.31，SEQC2 consensus TVAF 約 0.05）。local-state 關係本身只是候選模型，更不能由 VAF 斷定 parent/child。
先依 pos3=A / pos3=G mutation anchor 分組後，部分 CpG 呈方向一致差異，3.1/3.2 在同一 biological sample 的 HKU／DORADO technical datasets 間技術重現；read-ID 集合是否完全一致未驗證。這是有界關聯；pos3=G group 不是 block L/R 已合併的證據，也不是獨立 clone confirmation。
independent_audit.json 注入；權威矯正見 頁 05 §④：{2.1,2.2,3.1,3.2,5.1,5.2} 為 normal-ASM-screen-negative，其中 3.1/3.2 跨 basecaller 技術重現最強；{3.3,3.4,3.5,4.1} 被既存 ASM confound。screen-negative 不證明 acquired 或 clone-specific。套用校正後，只能畫出 recurrence-allowed 的mutation-state compatibility graph。marker 共現/互斥是觀測；圖不提供祖先、方向或順序。甲基只描述遺傳分組後的 association，不能補 genetic link、合併未連鎖 block 或定向 topology edge。
這節是「how we verified」— 把這個案例從「肉眼觀察」升到「可複核結論」用了哪些手段。
samtools faidx GRCh38 chr2:18096244-18096294 取序列，親眼確認 pos4 之後是正好 20 個 T 的同聚物 → 校正有源碼級依據，不是憑印象。wf_668e592a-84a。_assets/data/ 對應檔案 grep 到。教學頁不藏限制。這是單一樣本、單一區域的候選案例，不是 cellular-clone truth，也不是論文的全部證據；推廣前有明確前置。
| 限制 | 意涵 |
|---|---|
| 單一區域案例 × 單一 biological sample × 兩 technical datasets | cross-basecaller 是同樣本技術重現，非獨立 biological replicate → 天花板 L2。 |
| 兩個最強判別子各落 confound 區 | pos3（最強 somatic）落 SEQC2 HC 空隙不可 truth 驗；甲基 flip 的 distal CpG 在 DORADO 不複製。視為 descriptive exception，勿推廣到 non-LOH 位點。 |
| DORADO input roles | raw 5mC input無HP；另有separately haplotagged tumor input供HP imbalance比較。兩者不可混稱同一input。 |
| HKU tagged denominator | HP2=232、HP1=4、untagged=44；HP1比例固定用4/236 tagged=1.7%，不是4/280全部dedup reads。 |