解釋頁 05 · 第二輪程式複核 · 04 案例走查的審計姊妹篇

第二輪計算複核：每個推論支持到哪裡？

本頁以重算腳本、matched-normal ASM screen 與跨 basecaller FDR 對推論 1–6 逐一複核；重跑結果 byte-identical，code path 數字吻合。這是同一生物樣本的分析/技術複核，不是獨立 biological replicate，也不把候選模型升格成 cellular clone 真值。

L0 一眼看懂權威裁決

SEQC2 LOH annotation + HP imbalance、candidate alleles 與 read 連鎖支持區域 molecular-state candidates；完整 cellular clone identity / fraction / phylogeny 未證。此分析未整合 allele-specific CN，不能區分 CN-loss、cnLOH、事件機制或保留哪一條親本 copy。甲基只在 mutation-defined 分組後呈局部關聯，且有跨 basecaller 技術重現；它不能建立、合併或定向 topology edge，也不是獨立 clone 驗證。

「Local, LOH-annotation-compatible molecular-state candidates with bounded, mutation-conditioned methylation association.」— 不是「Confirmed cellular subclones or evolutionary reconstruction.」

▸ 給教授一句話：原始 5 群的 pos4 G/T/DEL 三分不成立；歷史 merge rule 所稱「約 3」只是一組 operational labels，不是生物數量下界或完整 block-resolved count。尤其 (1)(2) block L 與 (4)(6) block R 無跨距 read，關係 unresolved。甲基關聯必須用 matched-normal 標記既存 ASM confound — tumor-associated、normal-ASM-screen-negative 子集 = {2.1,2.2,3.1,3.2,5.1,5.2}，而 {3.3,3.4,3.5,4.1} 被既存 germline ASM confound；甲基不補 block 關係。

相容

推論 1 LOH context（SEQC2 註記 + HP imbalance；CN 機制未解）

否定×2

推論 3（HP2 消失）+ 推論 6（pos4 三群）

重寫

推論 4（pos3 與 1/2/6 互斥，不能同 trunk）

6 / 4

normal-ASM-screen-negative / confounded CpG（前者未證明 acquired）

● 這個案例可以說什麼、不可以說什麼（claim 邊界）

可以說：在 SEQC2 LOH annotation + HP imbalance 相容的 context 中，由 sequence-variant alleles 的 read-level 共現／互斥定義 regional molecular-state candidates；其中 5 個位點為 SEQC2 truth-evaluable TP，(3) 為 truth-unevaluable tumor-associated candidate。在現有覆蓋 reads 中，(5)C 只與 (3)A 同現，是條件包含 pattern；不證 parent-child、取得順序或 cellular lineage。甲基跨 basecaller 僅為同一生物樣本的分組後 association，不能補 genetic link 或 topology edge。
不可以說：5 個 subclone 已證實 / 完整演化順序已確認 / 甲基造成突變 / 甲基獨立重建完整 clone tree / DORADO 是獨立病人（它是同細胞株技術重現）。
關鍵紀律：此區域同時有 normal haplotype ASM 與 tumor-associated allele-methylation — ISM 的價值是把兩者拆開，不是把所有甲基差異都歸給 subclone。

① 推論 1-6 權威裁決

第二輪 audit 對使用者六個推論的逐一判定（重算腳本 + 跨 basecaller + FDR + normal 控制）。

推論	裁決	修正版
1. LOH context	相容 · 有界	SEQC2 LOH BED `chr2:16,146,119–22,100,000` + HP imbalance（HKU HP2 label 232/HP1 4 ≈98.3%；DORADO 279/1 ≈99.6%）方向一致；未整合 allele-specific CN，不能判定 CN-loss vs cnLOH、事件機制或 retained parental copy。
2. 存在分子狀態分支	支持 · 有界	可稱 regional molecular-state candidates；非 biological clone truth。
3. HP2 沒抽到/突變到不見	否定	HP2 是 dominant haplotag label；all-REF 短連鎖 read 存在（BQ20／≥2 點：HKU 17、DORADO 15；≥3 點：HKU 4、DORADO 0）；這些是 local read patterns，非已觀測 ancestor。缺完整跨點 read 是 coverage 限制，不代表某親本 copy 消失。
4. (1)(2)(3)(6) 先突變	不成立 · 需重寫	(3) 與 (1)(2)(6) 互斥；只可稱互斥的 local molecular-state candidate labels，不確認 trunk、early branch 或 cellular lineage。
5. (5) 把群一、群二分開	候選 · 有界	現有覆蓋 reads 中，`(5)C` 只與 `(3)A` 同現；double-ALT read HKU 4 / DORADO 2 → 支持 read-level 條件包含的 local-state candidate，不證 parent-child、取得順序或 cellular lineage。
6. (4) 多突變造成三群	否定	`C>G` 為 truth-evaluable TP；鄰接 homopolymer 的 G/T/DEL 三態標為 block R 內 operational pos4-altered state，不可拆三群。

與頁 04 的差異（本頁修正）：頁 04 把推論 4 寫成「骨幹共現獲證、僅順序 L3」— 偏寬。目前 coverage 與 filters 下，pos3 與 pos1/2/6 的 read-level ALT pattern 互斥，否定的是已測的「四者同一 read-level co-ALT block」表述；absence／互斥本身不能判定哪個先發生、parent-child、cellular branch 或 lineage。

② 三個資料口徑先修正

在談結論前，audit 先修了三個會誤導的口徑。

修正 1(4.1) CpG 座標誤植

文字中的 chr2:18,096,041 在 GRCh38 是 A，不是 CpG。正確 (4.1) CpG = chr2:18,096,340 C>G dinucleotide（圖上標的 18,096,341 是其 G 座標）。早期腳本因此漏掉真正的 4.1，已重算。

修正 2(3) 不是 SEQC2 FP，是 truth-unevaluable

(1)(2)(4)(5)(6) 都在 SEQC2 truth VCF（PASS）。(3) 落在 HC BED 空隙（上段止 18,085,984、下段起 18,086,058）→ out-of-HC / truth-unevaluable，不是可由 SEQC2 判定的 FP。兩套 tumor 都 G>A PASS 且 sampled matched normal 未見 A（HKU 0/18、DORADO 0/27）→ 支持 tumor-associated sequence candidate；陰性 normal sampling 不證明 acquisition/somatic causation，也不能升 truth-confirmed TP。

修正 3Normal 並非「每個 call 都是 REF」

兩套 normal 都沒有六個預期 somatic ALT，但仍有少數 ONT error call（DEL/T）。正確說法：matched normal 未觀察到預期 somatic ALT；但不是每個 normal base 都絕對等於 REF。

③ read-level 連鎖實際支持什麼（00/10/01/11）

unique primary read、MAPQ≥20、BQ≥10 重算。11 = 兩事件同時在同一 read。這是 same-molecule 共現／互斥與 local molecular-state pattern 的直接證據，不是 cellular lineage 的直接證據；confirmed cellular lineage = 0。

事件組合	HKU 00/10/01/11	DORADO 00/10/01/11	判讀
(1)G vs (2)C	18 / 0 / 0 / 13	11 / 1 / 0 / 6	共現 (1)(2) same-read／同 local-state block candidate
(1)G vs (3)A	3 / 3 / 7 / 0	跨距不足	互斥
(2)C vs (3)A	3 / 5 / 9 / 0	0 / 1 / 0 / 0	互斥
(3)A vs (5)C	8 / 1 / 0 / 4	1 / 2 / 0 / 2	條件包含 pattern目前有覆蓋 reads 中 (5)C 只見於 (3)A；僅為 local molecular-state candidate，不證 parent-child、取得順序或 lineage
(3)A vs (4)non-ref	0 / 9 / 13 / 0	0 / 7 / 5 / 1	主要互斥（DORADO 1 discordant）
(3)A vs (6)G	0 / 3 / 3 / 0	跨距不足	互斥
(4)non-ref vs (6)G	9 / 0 / 0 / 10	1 / 0 / 0 / 1	同 state；順序不可分
(5)C vs (6)G	3 / 7 / 11 / 0	1 / 7 / 0 / 0	互斥 provisional alpha-1 label 與 block R marker

可直接觀察：① (1)(2) same-read 共現；② (3) 與 (1)(2)/(4)/(6) 互斥；③ (5)C 只出現在帶 (3)A 的有覆蓋 read；④ (4) 與 (6) 在 HKU 完全共現。這些 pattern 與 alpha-like、block L、block R 與 provisional conditional local molecular-state candidates相容，但不能直接推出 cellular branch、ancestor/child 或突變順序；confirmed cellular lineage = 0。

不能直接推出：(1)(2) 與 (4)(6) 沒有足夠直接跨 36–40 kb 的 genetic linkage read，因此必須保持為關係 unresolved 的 block L / block R。分組後甲基一致性是 association-only，不能橋接、合併或定向兩 block，也不能建立 broad beta common node。六點單一路徑完整 read 幾乎不存在，不能畫成已確認 phylogeny。

④ 甲基化：哪些跨 basecaller 複製、哪些被既存 ASM confound

matched-normal HP1/HP2 screen 能標記已觀察到的 germline-ASM confound；未達顯著者只能稱 normal-ASM-screen-negative，不能由陰性 screen 證明 tumor-acquired 或 subclone-specific。

(a) mutation-defined 組間甲基差異與跨 basecaller 技術重現

CpG	HKU A→G mean	HKU MW-FDR	跨 basecaller	normal ASM?	判定
2.1	0.75 → 0.48	0.176	方向一致	未偵測 (FDR 0.41)	SCREEN-NEG / 弱
2.2	0.90 → 0.22	0.0032	技術重現	未偵測 (FDR 0.055)	SCREEN-NEG
3.1	0.22 → 0.92	3.3e-4	技術重現	未偵測 (FDR 0.41)	SCREEN-NEG ★
3.2	0.97 → 0.14	4.1e-5	技術重現	未偵測 (FDR 0.50)	SCREEN-NEG ★
3.3	0.42 → 0.84	0.025	複製	有 (FDR 0.007)	ASM confound
3.4	0.04 → 0.87	4.1e-5	方向(DORADO 未過 FDR)	有 (FDR 0.007)	ASM confound
3.5	0.01 → 0.87	0.0017	方向(DORADO 未過 FDR)	有 (FDR 0.050)	ASM confound
4.1(校正座標)	0.98 → 0.14	0.0027	複製	有 (FDR 0.007)	ASM confound
5.1	0.03 → 0.95	0.0060	小 n / 未確認	未偵測 (FDR 0.30)	SCREEN-NEG
5.2	0.03 → 0.99	0.0060	小 n / 未確認	未偵測 (FDR 0.41)	SCREEN-NEG

tumor pos3-anchored A-vs-G + normal HP1-vs-HP2 ASM 皆親讀 independent_audit.md。綠列=tumor-associated、normal-ASM-screen-negative（非 acquired 證明）；紅列=既存 germline ASM confounded。

(b) matched-normal 揭露的既存 ASM（為什麼必須扣）

Matched-normal HP1 vs HP2 germline allele 甲基不對稱顯著者： 3.3 HP1=0.814 HP2=0.046 MW-FDR 0.0070 3.4 HP1=0.033 HP2=0.850 MW-FDR 0.0070 3.5 HP1=0.583 HP2=0.012 MW-FDR 0.0496 4.1 HP1=0.887 HP2=0.078 MW-FDR 0.0070 → 這四個 CpG 的 mutation-group 甲基差異受既存 germline ASM confound，不能宣稱 acquired 或 clone-specific。 2.1/2.2、3.1/3.2、5.1/5.2 在本 screen 未見顯著 normal HP 差異 → normal-ASM-screen-negative 候選。

校正結論：normal-ASM-screen-negative 子集 = {2.1, 2.2, 3.1, 3.2, 5.1, 5.2}；其中 3.1 / 3.2 的組間差異與跨 basecaller 技術重現最強。{3.3, 3.4, 3.5, 4.1} 被既存 germline ASM confound。這個分類是 confound screen，不是 acquisition 或 clone identity test。

nuance：為何不能從 LOH annotation 推導甲基機制？

本案只有 SEQC2 LOH annotation、HP imbalance 與 matched-normal ASM screen；沒有整合 allele-specific CN，因此不能判定 CN-loss、cnLOH、哪個 parental copy 被保留，或 germline ASM 如何延續到 tumor。3.3/3.4/3.5/4.1 在 normal 兩 HP 已有顯著差異，故保守標為 confounded；這是風險標記，不是 LOH 或甲基機制的證明。

(c) tumor vs normal 差異甲基也跨 basecaller 複製

以所有 read 直接比 tumor vs matched normal，HKU 與 DORADO 在 2.1/2.2、3.1/3.2、5.1/5.2 都有同方向 + 過 FDR 的差異（例 2.1：HKU 0.525/0.030 q=7.7e-4、DORADO 0.497/0.016 q=3.5e-4）。但 all-read tumor/normal 差異仍混合 tumor composition + LOH + haplotype ASM，須再用 allele-conditioned 與 normal-HP-conditioned 拆解。

⑤ 可防守的非時間、非唯一 compatibility graph

只把 read-level 共現／互斥與條件包含畫成相容摘要；圖不含 ancestry、方向或取得順序。block L / block R 沒有直接 genetic bridge，關係必須保持 unresolved；甲基 association 不建立任何 topology edge。

圖 1 · chr2:18M 非時間、非唯一的 read-state compatibility graph

來源：verdict_02 §九 + linkage 表（independent_audit.md）。tier：same-read 共現／互斥與條件包含 pattern L2；本圖只作非時間、非唯一的 compatibility summary。block L / block R 無跨距 read，因此不合併；甲基是 association-only，不能補 genetic link、common node、direction 或 ancestry。

⑥ pos3 (3) — tumor-associated sequence candidate（truth-gap）

(3) 不是可由 SEQC2 判定的 FP：它落在 HC 空隙、屬 truth-unevaluable。Tumor/normal 觀測支持 tumor-associated candidate，但不證明 acquired/somatic causation，也不能升 truth-confirmed TP。

資料	Tumor A / G (BQ20)	Normal A / G (BQ20)	truth 狀態
HKU	29 / 30	0 / 18	`out_of_hc_truth_unevaluable` HC 空隙 18,085,984–18,086,058
DORADO	21 / 27	0 / 27	`out_of_hc_truth_unevaluable` HC 空隙 18,085,984–18,086,058

結論：(3) 有多條雙股 tumor ALT 分子支持，且 sampled normal reads 未見 A，故為 tumor-associated sequence candidate；但陰性 normal sampling 不證明 acquisition/somatic causation。它落在 SEQC2 HC 空隙，外部 truth 不可評估，不能升 truth-confirmed TP。

⑦ claim 邊界 + 外部方法學對齊

把這案例放回 ISM 研究定位，並用外部文獻劃 claim 邊界。

ISM 在這案例的價值 ① 同一長讀聯合觀測 allele + haplotag + native 5mC；② 找跨 basecaller 技術重現的 allele-CpG association；③ 補 regional molecular-state characterization；④ 用 matched normal 揭露已偵測的 ASM confound；⑤ 用多點 read linkage 提出帶不確定性的局部 mutation-state 候選模型。

外部對齊（claim 邊界）

文獻	對本案例的意涵
Tarabichi et al., Nat Methods 2021	正式 subclonal reconstruction 需處理 genetic backbone / CN-purity / clustering / phylogeny / 不確定性 → 本案例只到 regional states，不宣稱完整 phylogeny。
Liu/Goretsky et al. 2025 preprint	最接近的 long-read subclone multi-omics：以 SNV 建樹、再把 methylation 掛到 lineage → 支持「genetic backbone + methylation characterization」框架。
LongPhase-S preprint	somatic haplotagging 是本案例 genetic backbone；ISM 差異化 = 加入有界、normal-aware 的 read-level methylation interpretation。

目前適合用語：Local, LOH-annotation-compatible mutation-state candidates with bounded, mutation-conditioned methylation association.
不適合：Confirmed cellular subclones or evolutionary reconstruction.

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