解釋中心
解釋頁 06 · 方法構想 · 局部分子狀態候選 pipeline

ISM 怎麼系統化分析局部 mutation-state candidates？

把 chr2:18M 案例的 read-level 分析萃取成 9 步候選流程：建立局部 mutation states、標記 homopolymer artifact、描述分組後甲基關聯，並用 matched-normal screen 標記已偵測的 ASM confound。它不能把 screen-negative 證成 acquired，也不是已實作或已驗證的 cellular-subclone 重建器。

L0 核心構想（B0）

在同一條長 read 上聯合觀測 candidate allele + haplotag + native 5mC，於 LOH-annotation-compatible + somatic-haplotag-conditioned 框架下，用多點 read linkage 定義 regional molecular-state candidates，再用 normal-anchored 甲基 screen標記既存 germline ASM confound → 輸出有不確定性的區域分子狀態 characterization（非 cellular clone / 完整 phylogeny）。SEQC2 註記與 HP imbalance 不等於 allele-specific CN 機制定案；甲基只作分組後 association，不建立 topology edge。

▸ 給教授一句話：這個 pipeline 不是「找到甲基差就宣稱 subclone」；它先用 read linkage 的互斥/共現建立候選分子狀態、用 homopolymer guard 擋定序假象，再用 matched-normal ASM screen區分「已偵測到既存 ASM」與「tumor-associated、normal-ASM-screen-negative 甲基關聯」。後者仍不證明 acquired 或 cellular subclone。

⚠ 定位：這是「構想基礎」，不是已交付的自動化模組
  1. 9 步流程目前是個案手做驗證可成立（chr2 單一區域案例含 6 sSNV + BRCA2 單 locus，L2）；系統化（自動化 + 標準化判準）是 handoff B2 的目標，屬 future work。
  2. 每步的「判準/閾值」來自案例落地值（如互斥 0 個 11、cross-basecaller 過 FDR、pos4 20bp poly-T mask），可作標準化起點，但須跨樣本再校準。

① 9 步 pipeline 一圖看懂（四個階段）

輸入 → 局部 mutation states → 甲基關聯（含 ASM screen）→ 候選輸出。紅框 = 防呆護欄所在步驟。

圖 1 · regional molecular-state candidate 分析 pipeline（9 步 / 4 階段）
階段 I · 輸入 階段 II · mutation states 階段 III · 甲基 階段 IV · 輸出 1 萃取矩陣 read×sSNV×5mC（pysam） MAPQ≥20 · BQ≥10 · 先落 JSON 護欄：dedup（案例 340→280） 2 LOH context LOH BED annotation + HP imbalance 案例 98.3% / 99.6% · normal ALT=0 context 相容；allele-specific CN 未整合 3 linkage compatibility 00/10/01/11；0 observed「11」=互斥 pattern 高「11」=同 state 護欄：跨距不足→標「不可判」 4 artifact guard 🛡 homopolymer context check 案例 pos4 後 20bp poly-T G/T/DEL 合併為單一 altered state 5 甲基判別 per anchor Mann-Whitney + BH-FDR 要求 cross-basecaller 同向+過 FDR 6 normal-HP ASM 控制 🛡 normal HP1-vs-HP2 顯著→confounded confound: 3.3/3.4/3.5/4.1 normal-ASM-screen-negative: 2.1/2.2/3.1/3.2/5.1/5.2 7 tumor/normal diff all-read MW FDR 跨 basecaller 仍混 composition/LOH/ASM → 再拆 8 建非時間相容圖 conditional pattern；不定向、不排序 無 direct bridge → block relation unresolved 甲基 association 不新增 topology edge 9 誠實 tier regional/operational · L2 · 單一區域案例 禁「confirmed N-subclone」 用 verdict_02 用語 regional state candidates characterization + 不確定性標記 🛡 3 條防呆（案例抓出的過度宣稱根因 → 系統化必內建） ① homopolymer artifact（步 4） variant 後接 homopolymer → G/T/DEL 三態標 uncertain，不能當多個 subclone。 案例 pos4 20bp poly-T → 「5 群」撤回；歷史約 3 只屬特定 merge rule labels。 ② VAF 不可排序 siblings（步 8） LOH 註記區的 CN/純度機制未解；案例 pos5 局部 0.31 vs 全基因組 0.05。 → conditional containment 只約束相容模型，不確認 parent/child、方向或順序。 ③ coverage 假象（步 8） 缺跨多點 all-REF read ≠ ancestral allele 消失（read-length 限制）；root 是 parsimony 推論非觀測。
怎麼讀：四階段由左到右；步 4 / 步 6 是兩個關鍵護欄（紅框）— homopolymer guard 與 normal-HP ASM 控制。底部紅區 = 3 條防呆對應的步驟。來源：Part B B1/B2（20260615_chr2_subclone_case_and_method_concept_01.md）。

② 9 步的判準與護欄（B1）

每步附「案例落地的判準」與「護欄」。這是把個案手做變成可標準化判準的起點。

步做什麼判準 / 閾值（案例落地）護欄
1萃取 read×sSNV×5mC 矩陣unique primary、MAPQ≥20、BQ≥10；MM/ML 解碼 5mC 映回 ref；數字先落 JSONdedup（案例 340→280）
2LOH contextSEQC2 LOH BED annotation + HP imbalance（案例 98.3%/99.6%）；matched-normal ALT=0只判 context-compatible；未整合 allele-specific CN，不能判 CN-loss vs cnLOH、機制或 retained parent
3mutation-state linkage00/10/01/11，要求跨位點 read；0 observed 11 只支持互斥 compatibility pattern，共現支持同分子 state，但都須保留 coverage/error/recurrence 不確定性跨距不足 → 關係標 UNRESOLVED
4 🛡artifact guardhomopolymer context check（案例 pos4 C>G 為 truth-evaluable TP；鄰接 20bp poly-T 的 G/T/DEL 三態標 homopolymer-uncertain，不拆三群）ONT homopolymer/strand-bias 必查；單 strand call 不算群
5甲基判別 per allele anchorMann-Whitney + BH-FDR；要求 cross-basecaller 同方向 + 過 FDR單 basecaller n=1 不可解；distal 未複製 → 排除
6 🛡normal-HP ASM screennormal HP1-vs-HP2 顯著者（案例 3.3/3.4/3.5/4.1）標 confounded；其餘稱 tumor-associated、normal-ASM-screen-negativescreen-negative 不證明 acquired/clone
7tumor/normal differential cross-checkall-read tumor vs normal MW FDR；同方向跨 basecallerall-read 差混 composition/LOH/ASM → 須 allele+normal-HP conditioned 再拆
8建非時間 compatibility graphread-level conditional pattern 只約束相容模型（案例 (3)/(5)），不確認方向或取得次序；無 direct bridge → block 關係保持 unresolved；甲基 association 不補 link、common node 或方向共現／absence／VAF 均不可單獨判定 parent-child
9誠實 tierregional molecular-state candidates；標 L2/單一區域案例；nesting 亦只支持 provisional model禁「confirmed N-subclone」

③ 三條防呆（B2）— 為什麼這 pipeline 不會重蹈覆轍

這三條正是 chr2 案例「早期過度宣稱」的根因；系統化時必須內建為硬性檢查。

防呆 1homopolymer artifact

variant 後接 homopolymer → 多 allele call（G/T/DEL）須標 homopolymer-uncertain，不能直接當多個 subclone。必查 context。

案例：pos4(18,096,269) 後接 20bp poly-T → 原「5 群」撤回。歷史 merge rule 所稱「約 3」只是 operational labels；block L/R unresolved，不是 biological lower bound、完整 candidate count 或 clone 數。

防呆 2VAF 不可排序 siblings

此區有 LOH annotation + HP imbalance，但 allele-specific CN、純度與機制未整合；局部 VAF 不可用來排 parent/child。nested read pattern 只能約束相容的局部模型，不能單獨確認方向或突變順序。

案例：pos5 局部 VAF 0.31 vs 全基因組 0.05 → VAF 排序撤回；(5)C 僅在帶 (3)A 的 shared-coverage reads 中出現，是無方向的 conditional containment pattern。

防呆 3coverage 假象

缺「跨多點 all-REF read」≠ ancestral allele 消失（read-length 限制）；root 是 parsimony 推論非觀測。

案例：「無 ancestral REF read」撤回 — BQ20 all-REF local patterns 在 ≥2 點為 HKU 17 / DORADO 15，≥3 點為 HKU 4 / DORADO 0；這不證明已觀測祖先細胞，缺跨 ≥4 點仍是覆蓋限制。

④ ASM 控制 = ISM 對此案例的關鍵方法增值（B3）

這是整個 pipeline 最重要的一步，也是 ISM 區別於「只 flag 甲基差」的工具的地方。

圖 2 · 為什麼需要 normal-anchored ASM 控制
matched-normal ASM confound screen 概念 將 tumor mutation-defined methylation association 與 normal HP1/HP2 差異對照，標記已偵測 germline ASM confound。screen-negative 不證明 tumor-acquired 或 clone-specific methylation。 問題 LOH annotation + HP imbalance；allele-specific CN 未整合。 不能判 CN-loss vs cnLOH、機制或哪個 parental copy 保留。 因此甲基差只作 association，不能直接當 subclone 或 topology edge。 ISM 解法：matched-normal HP1-vs-HP2 當 filter normal 已有 ASM 的 CpG → 保守排除（confounded） normal ASM screen 陰性 → 留為 tumor-associated 候選 = C2 normal-anchored cis/ASM control 的具體展現 confounded（既存 germline ASM） 3.3 · 3.4 · 3.5 · 4.1 normal HP1/HP2 已顯著差 → 保守排除 ✔ tumor-associated、normal-ASM-screen-negative 2.1 · 2.2 · 3.1 · 3.2 · 5.1 · 5.2 未證明 acquired / clone；最強關聯 3.1/3.2
怎麼讀：SEQC2 LOH annotation + HP imbalance 只界定相容 context；沒有 allele-specific CN，不能推導 CN-loss、cnLOH、事件機制或 parental-copy retention。matched-normal HP1-vs-HP2 screen 可標出已偵測的 ASM confound；screen 陰性仍不證明甲基化為後天取得或 cellular-subclone-specific，且甲基不能橋接 topology edge。來源：Part B B3 + Part A A5（ASM-control 表，引自 independent_audit.md）。
核心訊息（這就是研究的方法價值）：此區同時有 normal haplotype ASM 與 tumor-associated 甲基關聯 — ISM 的價值是用 matched-normal 標記已偵測的 ASM confound，而非把所有甲基差都歸 subclone。normal-ASM-screen-negative 子集與遺傳分組相容，但不證明甲基化是後天取得或來自某個 cellular subclone。

⑤ 從個案到系統化（B4）— 升 validated 的關鍵路徑

目前是個案手做 L2；要升 validated 需要把 9 步自動化 + 標準化判準 + 跨樣本複製。

現況 → 目標 現在：個案手做 L2（chr2 單一區域案例含 6 sSNV + BRCA2 單 locus）。升 validated 需：① B1 九步自動化成 ISM 模組（read→molecular-state assignment + ASM-control + non-temporal compatibility graph with unresolved relations）；② 標準化判準（互斥閾值、FDR、cross-basecaller 複製、homopolymer mask、ASM-control gate）；③ 第二 LOH 區域案例/第二樣本（破單一區域案例限制）；④ 第二 caller/pipeline（破 DORADO=同細胞株技術重現非獨立病人）。
handoff內容狀態
B2個案 → 系統化 + 標準化判準（9 步自動化）= 主軸升 validated 關鍵future
B5within-HP null / ASM-control已部分跑
B7跨樣本複製★4 目標
B4第二 caller（破同細胞株技術重現）future
案例走查 04 案例 audit 05 ISM 方法本體 ← INDEX